Fluoresans nanoskopi, uzaysal çözünürlüğü (rezolusyon) optik
difraksiyon limitinden birkaç kat daha yüksek (~ 200 nm) bir optik mikroskop kullanarak
fluoresans objelerin tayinine yönelik bir tekniktir.
Son yıllarda fluoresans mikroskopi alanında, optik
rezolusyon difraksiyon bariyerinin kırılmasına ve ~10 nm'lik benzeri görülmemiş
bir rezousyon elde edilmesine izin veren birkaç yeni yaklaşım geliştirildi.
Bütün bu yaklaşımlara floresan nanoskopinin ortak adı verildi. Floresan
nanoskopi sistemleri temelde üç farklı yaklaşıma dayanır:
1. Yeni optik sistemlerin geliştirilmesi ve yüksek açısal
aralıklı lenslerin (4Pi, I5M ve I5S mikroskopi) uygulanmasına bağlı olarak
geliştirmiş odaklanma.
2. Toplam iç yansıma olgusunun kullanımı (toplam iç yansıma
fluoresan mikroskopisi, TIRFM).
3. Fluoresans moleküllerin ‘açık (switch on)’ ve ‘kapalı (switch
off)’ kontrolü ve adım adım taini (STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM,
STORM, PAINT).
Nanoskopi teknikleri, biyoloji ve tıpta çeşitli potansiyel
uygulamalardır. Nanoskopi, proteinler, DNA ve RNA arasındaki etkileşimlerin
doğrudan incelenmesini sağlar; bu nedenle, genomik ve proteomiklerin
geliştirilmesinde, hücrelerin fizyolojisinin incelenmesinde ve protein
komplekslerinin oluşumundaki kusurların patofizyolojik proseslerini anlamada,
v.s. kilit rol oynayabilir.
Bu yaklaşımlar, daha ayrıntılı olarak tanımlanabilir:
1. 4Pi ve I5M iki-lensli bir sisteme dayanır; odak
noktasında iki karşıt küresel dalganın karıştırılmasıyla optik eksen boyunca
çözünürlük 80 nm'ye kadaryükseltilebilir. I5S de odak düzleminde (100 nm'e
kadar) gelişmiş çözünürlük sağlar.
2. TIRFM (total internal reflection fluorescence
microscopy), arayüzde fluoresans objelerin tespit edilmesine izin verir; ~100
nm kalınlıktaki tabaka maksimum çözünürlük 10 nm.
3. STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT.
Bir molekül bir fotonu absorbe ettiğinde, temel enerji seviyesinden (S0)
gelen bir elektron, uyarılan fluoresans seviyesine (singlet S1 veya
triplet T1) geçiş yapar. Foton absorpsiyonu aynı zamanda,
molekülerarası reversibil yeniden düzenlenmeyi (örneğin
cis-trans-izomerleştirme) indükleyebilir ve fluoresans spektrumunda değişikliğe
neden olabilir. S0 → S1 ve S0 → T1
geçişleri fluorofor aktivasyon / deaktivasyon ve çözünürlük (rezolusyon)
yükseltilmesi için kullanılabilir.
Böylece, STED (stimulated emission depletion) mikroskopisi,
İki ışık demetinin aynı anda kullanılmasına dayanır. Bunlar merkez bölgedeki fluoroforları
uyaran odaklanmış bir demet (S0 → S1) ve merkez bölgesi
çevresindeki fluoroforlar söndüren odak düzleminde çörek şeklinde bir demet (S1
→ S0). Böylece, flüoresan sadece ‘çörek boşlugu’nda kayıtlı
olacaktır. Bu yöntem kullanılarak elde edilen rezolusyon (d),
l
d = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
2n sin a(1 + aImaks./Is)1/2
Is = S1 → S0 geçişi için
gerekli ışın gücü, Imaks. = söndürme (kuenç) ışın gücü
Bu nedenle, çözünürlük düzenlenebilir (ışık kaynağının
gücüne bağlı olarak) ve potansiyel olarak sonsuzdur (Imax/Is→
∞ ise). Şimdiye kadar elde edilen pratik eşik, biyolojik makromoleküllerin
boyutna tekabül eden ~10 nm'dir.
Aynı prensip, SSIM (saturated structured illumination
microscopy) veya SPEM (saturated pattern excitation microscopy)’de kullanılır.
GSD (ground state depletion) mikroskopi, benzer bir yaklaşımı temel alır
(uyarılmış halin, molekülün daha uzun ömürlü bir duruma geçişinden dolayı
söndürüldüğü durum hariç). RESOLFT (reversible saturable optical fluorescent
transition) mikroskopi, PALM (photoactivation localisisation microscopy) ve
STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), fluoroforların,
fotokimyasal izomerleşmesinin bir sonucu olarak aktivasyon / deaktivasyonuna
dayanmaktadı
Bu metotlar, fluoroforların 3D bölgesindeki yerini analiz
etmek için farklı yaklaşımlar kullanır. STED, GSD, SPEM/SSIM ve RESOLFT,
verilen bölge koordinatlarından gelen sinyalin kademeli olarak kaydedilmesinde
optik odaklamayı kullanır; PALM ve STORM fluoroforları rastgele deaktive eder.
